１８６４年（元治元年）６月５日。京都は三条小橋の西にある旅籠・池田屋に集結していた長州系尊攘派の約２０名が新選組に襲撃され、斬殺・捕縛されるという事件が起こった。襲われた尊攘派は、前年８月１８日の政変で京都を追放された長州藩の勢力を回復するために、京都に火を放ち大混乱に陥れ、それに紛れて公武合体派の公家や京都守護職の松平容保（３０歳）を殺害し、天皇を長州藩に連れて行く、という「天皇動座」計画を立てていたという。この情報を聞きつけた新選組が捜査にあたっていた。池田屋で斬り合いが行われている最中に会津藩や桑名藩の兵も池田屋を包囲し、逃げようとした尊攘派はほとんどが捕らえられた。
この事件で、長州藩の主だった尊攘派の多くが命を落とした。新選組側にも死傷者が出たが、彼らは活躍を賞されて報奨金を受け取った。
翌６日、この事件に対して朝廷から会津藩への感謝状が届けられ、新選組は名前を挙げられて功を讃えられた。
しかし、長州藩は長州系浪士らの怒りの火に油を注ぐことになった。長州藩は藩兵を率いて京都に上洛し、実力で薩摩・会津藩を退けようとした。禁門の変（蛤御門の変）（きんもんのへん（はまぐりごもんのへん））である。
新選組がこの「天皇動座」計画を聞き出したのは、四条木屋町で薪炭商を営んでいた枡屋喜右衛門（ますや きえもん）を逮捕・拷問して入手した。枡屋の本名は古高俊太郎（ふるたか しゅんたろう）といい、近江の郷士であった。古高は長州系浪士と通じて情報提供などを行っていたという。
古高が捕まったことを知った浪士らは池田屋に集まり、古高の奪回と新選組攻撃について会議を行っていた。この会議には、吉田松陰門下の四天王と讃えられた俊才・吉田稔麿（よしだ としまろ）や、肥後出身で８月１８日の政変までは３０００人の親兵の総督を務めていた宮部鼎蔵（みやべ ていぞう）、尊攘派の人望が厚い土佐藩の北添佶摩（きたぞえ きつま）など、錚々たる顔ぶれであった。
池田屋事件は、新選組が大活躍した事件として有名である。当時の新選組は３４名で捜査にあたっており、八坂神社に集合した後、局長の近藤勇（こんどう いさみ）が１０名を率い、副長の土方歳三（ひじかた としぞう）が２４名を率いていた。永倉新八（ながくら しんぱち）の「浪士文久報国記事」によると、最初に池田屋に踏み込んだのは近藤ら１０名で、このうち屋内に切り込んだのは近藤勇、沖田総司（おきた そうじ）、永倉新八、藤堂平助（とうどう へいすけ）のわずか４名だった（残り６名は出入り口の押さえに回った）。４人ともかなりの実力者であるが、相手は約２０名ほどである。屋内は激闘になり、戦闘時間は１時間とも２時間とも言われている。途中から、騒ぎを聞きつけた土方の部隊が加勢に現れ、闘いは新選組の勝利で終わった。
この闘いで隊士１名は戦死、２名は負傷が原因で間もなく死亡。沖田総司は「病気にてひきとる」とあり、途中で戦線を離脱（肺結核の発作を起こした？）、藤堂平助が額を斬られて負傷したのをはじめ、負傷者の数は多かったようだ。
長州系尊攘派の会合に、長州藩士の桂小五郎（かつら こごろう：３２歳）が参加していた（する予定だった）が、彼は無事だった。後に
「会合に出席するために池田屋に行ったところ、他の者がまだ来ていなかったため、対馬藩邸で待っていたら事件が起こった。」
と彼は言っている。しかしその一方で、本当は彼は新選組に襲われると真っ先に逃亡して対馬藩邸に逃げ込んだのだ、という説を掲げている人もいる。